2017年SZU-iGEM获奖情况：

单项奖（Award）：最佳制造项目（Best Manufacturing Project）

奖牌（Medal）：金奖（Golden Medal）

项目成果简介：

众所周知，钢筋混凝土是世界上应用最广泛的建筑材料。混凝土抗挤压性更强，而钢筋可以承受较高的抗拉强度。它们结合在一起是用于建筑的完美搭配。

    然而，随着时间的推移，在混凝土内部会出现毫米级别的小裂缝。我们称之为微裂纹。这些微裂纹都有扩大和扩散的潜力，它们通常都会逃避人眼的检测。然后当裂缝变大时，空气中的水蒸气就会穿透并锈蚀内部的钢筋。生锈的钢筋会膨胀为原体积大小的3-4倍，导致墙体膨胀，裂缝进一步扩大。那么更多的水蒸汽和其他腐蚀性特征将进入内部腐蚀钢筋，使情况变得更糟。

    这种恶性循环将大大削弱钢筋，造成建筑物的安全问题并危及居住在其中人们的生命。更糟糕的是，这将大大降低隧道，桥梁等公共建筑的使用寿命。据调查，欧盟每年需要花费60亿元来对隧道和桥梁进行修复。 

    显然这是一个需要解决的问题。目前人们使用高压将无机水泥或其他类型的粘合剂泵入裂缝中，等待其变成固体，从而堵塞裂缝。但是这不是一次性可以解决的事情，相反，人们可能不得不经常这样做。它占用了大量的体力劳动，因此最终的花费实际上非常昂贵。

微裂纹修复的生物解决方案 

    为了以一种更简单的合成生物学方式给这个问题提供一个更好的解决方案，我们在本项目中尝试为混凝土设计一种“自愈”系统。也就是说，当出现微裂纹时，这个系统可以被激活，并开始进行自我复制。而碳酸钙被选作为这些裂缝的“药物”（修复材料）。

    整个想法是，构建一种可以生产碳酸钙的细菌，然后将它嵌入到混凝土中作为微胶囊。一旦混凝土开始破裂，胶囊就会裂开，激活里面的细菌。这样，他们就可以开始生产碳酸钙，从而填补了裂缝。

    在系统构建中，有三个必不可少的主要基因因素：

    孢子萌发。当液体L-丙氨酸可用于GerA受体诱导时，GerA基因用作启动孢子萌发的生物激素。

    碳酸酐酶。碳酸酐酶基因作为CO₃^2-产生模块，然后与游离Ca^{2 +}结合形成CaCO₃作为裂缝填充材料。

    碱耐受性。nhaC基因作为Na⁺-H⁺逆向转运蛋白，从而提高细菌对碱性环境的耐受性。

    通过合成生物学方法，显着提高了枯草芽孢杆菌的耐碱性，发芽率和矿化能力。 然后，项目团队用一种特殊的材料MCC将枯草芽孢杆菌的孢子包裹成微胶囊，同时加入必要的芽孢萌发所需的养分。 这种微胶囊以一定比例嵌入混凝土中。 当建筑物内部出现微裂缝时，微囊被破壁的张力撕裂，水分渗透溶解养分，刺激孢子进入萌发状态，最终恢复正常代谢。 枯草芽孢杆菌的碳酸酐酶促进CO₂水合生成HCO₃^2-，其与环境中的游离Ca^{2 +}和OH^- 结合形成碳酸钙沉积物，从而使微裂纹能够自我修复并隔离外部环境免受内部增强物的进一步腐蚀

底盘生物的选择

    我们选择了枯草芽孢杆菌作为底盘，因为它具有形成孢子（芽孢）的能力，这使得这种细菌长时间处于休眠状态，并保护自己免受恶劣的环境的影响，如瞬间极端高或低的pH，高温和干燥等。在枯草芽孢杆菌的所有菌株中，B.S168是最常见的一种。然而，由于该菌株的枯草芽孢杆菌分泌消化酶，其会阻断外源基因表达，所以项目团队选择了没有消化酶的基因修饰菌株WB800。 

平板上的WB800菌株

如何将细菌嵌入混凝土？

   为了使WB800在混凝土中正常工作来填补裂缝，要必须确保细菌仍然是芽孢状态，其他的因素不会中断这个状态的持续，除非裂缝出现。因此，需要将它们与外部环境隔离。在此考虑下，我们设计了一种由微晶纤维素材料构成的微囊，从外面掩护芽孢。MCC（microcrystalline cellulose）是微晶纤维素的简称，这是一种稳定的无毒复合材料，可以使芽孢与外界隔绝。同时，使用微胶囊包裹芽孢可以增加芽孢在单位体积中的浓度，提高修复效果。所以设计的这种微胶囊可以将芽孢状态的细菌正确地嵌入混凝土中。

细菌将如何工作？

• 激活芽孢萌发能力

    如上所述，嵌入在微胶囊中的芽孢一直保持休眠状态。为了唤醒它们，我们将gerA基因转移到了枯草芽孢杆菌中，并让其过表达。该基因编码内膜上的营养受体，可以检测外源营养物质，如L-丙氨酸，通过复杂的信号通路激活萌发，启动整个的系统。

• 抵制某些碱性环境

    考虑到“自愈”系统的工作环境是在pH值较高的地方，因此需要提高枯草芽孢杆菌的耐碱能力。这需要转移两个耐碱性基因到细菌中。

    1. 基因tupA的表达产生一种能使葡萄糖醛酸和L-谷氨酸转化为多聚葡萄糖醛酸和聚-γ-谷氨酸的酶。这些聚合物将在细胞壁上形成一层保护屏障并中和细胞外羟基。

    2. 第二个耐碱性基因是nhaC。它是细胞膜上质子泵的编码基因。这些质子泵通过将净氢离子和钠离子同时结合在一起，对调节细胞质的pH值起着关键作用，从而可以平衡细胞内的pH值。

• 产生CaCO₃填充裂缝

    自我修复系统的关键是让细菌生产碳酸钙来填补裂缝。为了实现这一目标，项目团队将碳酸酐酶的基因转移到了底盘枯草芽孢杆菌中。该基因产生高效酶，催化CO₂水合反应的可逆反应，并迅速形成碳酸氢盐和质子。碳酸氢根自由基会随着浓度梯度向胞外扩散，并与混凝土中的羟基铁和钙铁结合，形成碳酸钙沉淀。然后碳酸钙就可以去填充微裂纹，以对混凝土结构进行修复了。

（在扫描电子显微镜下）发生自愈状态。 （a）未掺入微胶囊的混凝土的微裂纹。 （b）投入B.subtilis WB800野生菌株微胶囊的混凝土的微裂纹。 （C）投入重组枯草芽孢杆菌WB800微胶囊的混凝土微裂纹。